Fülváladék és bőrkaparék mintákból kitenyésztett Malassezia pachydermatis gombák antimikotikum érzékenységének összehasonlító vizsgálata

Az állatorvosi praxisban egyre többször találkozunk bőr- és külső hallójárat-gyulladásos (otitis externa) esetekben gombás oktanú háttérrel, különösen krónikus elváltozások esetében. Hajlamosító tényezők hatására (lógó fül, túlzott faggyútermelés, felázás, stb.), illetve különböző betegségek következtében (pl. ektoparazitás fertőzöttség, endokrinopátiák, allergiák) a természetes flórát alkotó Malassezia pachydermatis képes elszaporodni és fertőzést okozni, illetve a fennálló tüneteket sújosbítani. A nem megfelelő gyógykezelés a folyamat idültté válásához vagy kiújuláshoz vezet. A pontos diagnózis és a célzott kezelés érdekében elengedhetetlen tehát a kórokozók fajszintű azonosítása és hatóanyag-érzékenységi vizsgálata.

Jelen tanulmány célja fülváladék és bőrkaparék mintákból kitenyésztett M. pachydermatis gombák antimikotikum-érzékenységi vizsgálatainak összehasonlítása. Bizonyos hatóanyagokkal szemben kialakult rezisztens törzsek előfordulása egyes esetekben a kezelés sikertelenségének magyarázatául szolgálhat.

Eredményeink szerint a M. pachydermatis törzsek között a ketokonazol, az itrakonazol és a klotrimazol esetében nőtt a rezisztencia előfordulási gyakorisága 2010 óta, ami azt mutatja, hogy a gombás bőr- és külső hallójárat-gyulladások esetében mindenképpen érdemes elvégeztetni az antimikotikum-érzékenységi vizsgálatot.

Irodalmi áttekintés

A Malassezia pachydermatis egy szaprofita élesztőgomba, amely több különböző melegvérű állat bőrén megtalálható, de leggyakrabban kutyák (és macskák) külső hallójárat-gyulladásából és bőrgyulladásaiból tenyészthető ki, illetve ritkán újszülöttek iatrogén vérfertőzéseiből is izolálható. A bőr mikroklímájának megváltozása vagy a védőmechanizmusok gyengülése, úgymint túlzott faggyútermelés, magas páratartalom, az epidermisz sérülése, a gombák elszaporodásához vezethetnek. Hajlamosító tényezők az allergiás, hormonális és bakteriális bőrbetegségek, ektoparazitás fertőzöttség, hosszabb távú glükokortikoid vagy antibiotikumos kezelés. Néhány kutyafajtában gyakrabban fordul elő, pl. west highland white terrier, cocker spániel, német juhászkutya, uszkár (1, 2, 5, 6, 9).

A pontos diagnózis felállítása és a célzott kezelés fontossága kevéssé vitatható, legfőképpen persze az állat szempontjából, de figyelembe kell venni, hogy a Malasseziák emberben is okozhatnak elváltozásokat és ennek egyik kockázati tényezője lehet a társállatok fertőzöttsége (8, 10) A gombás .megbetegedések másodlagosan kialakuló jellegéből adódik, hogy sokszor a nem javuló, krónikusan fennálló vagy újra és újra fellángoló elváltozások hátterében állnak (2). Bőr- és fülgyulladásokból a baktériumok (Staphylococcus intermedius, Proteus spp., Escherichia coli, Pseudomonas spp.) után a M. pachydermatis az egyik leggyakrabban izolálható mikroorganizmus. Ezért a gyógykezelésben antibiotikum mellett antimikotikumot, valamint a viszketést és gyulladást csökkentő, kombinált készítményt célszerű alkalmazni (3, 7).

Gombás fertőzések felderítésében a kórelőzmény és a fizikális vizsgálat mellett kiemelt fontosságú a Malasseziák jelenlétének igazolása (citológia, tenyésztés, szövettan), továbbá más, hajlamosító betegségek kizárása (1, 2, 7). A lenyomati készítmények, bőrkaparék és tamponminták festés utáni vizsgálatával az állat mellett felállítható az elsődleges diagnózis. Mivel a M. pachydermatis az egészséges állatok bőrén is előfordul, ezért a fertőzés igazolásához szükséges minimális gombaszám nincs egységesen meghatározva; egyesek szerint már néhány gomba is kórjelző értékű, mások csak a látóterenkénti magasabb számot tekintik diagnosztikai értékűnek (1,10,11).

A bőr- és fülgyulladások vizsgálatának másik legfontosabb eszköze a mikrobiológiai tenyésztés. Ezzel felderíthetők a leggyakrabban előforduló bakteriális okok, továbbá az antibiotikum-érzékenységi vizsgálat a lehető leghatékonyabb kezelést teszi lehetővé. Emellett a gombás háttér is igazolható (a kettős fertőzöttség igen gyakori lehet), illetve az élesztőgombák hatóanyag-érzékenységi vizsgálata is elvégezhető (1). Az antimikotikumok elleni rezisztencia megítélése azonban speciális ismereteket és tapasztalatot igényel, ugyanis Malasseziák tekintetében még nincsenek egységes irányelvek. Candida fajokra és más élesztőkre már léteznek nemzetközi ajánlások (Clinical and Laboratory Standards Institute: M27-A3 és M44-S3 dokumentumok), de ezek nem alkalmazhatók egy az egyben a Malasseziákra, speciális lipofil tulajdonságuk miatt. Mindazonáltal a MIC értékekben (Minimum Inhibitory Concentration) mutatkozó eltérések előjelezhetik az adott szerre való terápiás érzékenységet, ami felveti a rezisztens törzsek kialakulásának lehetőségét (4, 11).

Saját vizsgálat

Jelen tanulmány célja a Vet-Med-Laborba érkezett fülváladék és bőrkaparék mintákból kitenyésztett M. pachydermatis gombák antimikotikum érzékenységi vizsgálatainak összehasonlítása, különös tekintettel az egyes szerek ellen rezisztens törzsek előfordulására.

Anyag és módszer

A vizsgálat tárgyát a Vet-Med-Laborban 2010. június és 2013. február között kitenyésztett M. pachydermatis törzsek (összesen 86 minta) képezték. Ezek túlnyomó többsége fülváladékból (57 minta) és bőrkaparékból (27 minta) származott, 2 pedig hüvelyváladékból. A minták fajbeli megoszlása a következő volt: 81 kutyából (54 fülváladék, 25 bőrkaparék, 2 hüvelyváladék), 5 macskából (3 fülváladék, 2 bőrkaparék) származott.

A kutatásba bevont anyagokat standard mikrobiológiai táptalajokra oltva vizsgáltuk. A fülváladék és hüvelyváladék mintákat élesztőkivonatot, glükózt és klóramfenikolt tartalmazó Sabouraud agarra oltottuk ki, 7 napig szobahőmérsékleten (kb. 25°C) inkubáltuk, majd a telepeket mikroszkóp alatt vizsgáltuk egy csepp laktofenol kék oldatban szuszpendálva, 400-szoros nagyítással. A morfológiai jellemzők alapján a M. pachidermatis élesztőgombák egyértelműen azonosíthatók. A bőrkaparék mintákat három különböző gombameghatározó médiumra oltottuk ki: élesztőkivonatot és gentamicint tartalmazó ferde Sabouraud agarra, Dixon agarra és élesztőkivonatot és glükózt tartalmazó Sabouraud levesbe. A levest 7 napig szobahőmérsékleten inkubáltuk, ezt követően élesztőkivonatot, glükózt és klóramfenikolt tartalmazó Sabouraud agarra oltottuk tovább és újabb 7 napig inkubáltuk. A ferde agart és a Dixon táptalajt 14 napig tartottuk szobahőmérsékleten. A mikroszkópos azonosítást az előzőekben leírt módon végeztük (1, 6, 10). Az antimikotikum-érzékenységi vizsgálatot korongdiffúziós módszerrel végeztük, az adott időszakban rendelkezésünkre álló és a kereskedelemben hozzáférhető hatóanyagokkal (12).

A rezisztencia előfordulási gyakoriságának időbeli változását logisztikus regresszióval vizsgáltuk. (Azt a 3 mintát, amely a "mérsékelten érzékeny" kategóriába esett, kizártuk az elemzésből.) Először minden hatóanyagra külön elemzést végeztünk, amelyben a rezisztens minták arányát vizsgáltuk a dátum illetve az évszám függvényében. Ezután minden mintára kiszámoltuk az összes bevizsgált hatóanyagon belül azok arányát, amelyekre rezisztencia volt kimutatható (kivéve a terbinafint, a mikonazolt és a grizeofulvint, mivel ezekre a hatóanyagokra csak a teljes vizsgálati időszak egy-egy rövidebb időszakában készült tenyésztés). Az így kiszámolt össz-rezisztencia-arány időbeli változását elemeztük logisztikus regresszióval először az összes mintára, majd külön csak a bőrkaparékokra illetve csak a fülváladékokra.

A rezisztencia előfordulási gyakoriságát összehasonlítottuk az egyes hatóanyagok között is. Az elemzésbe csak a 2012.04.01. után bevizsgált mintákat vontuk be, mivel a rezisztencia az idő során eltérő módon változott az egyes hatóanyagokra, és a hatóanyagok egy részére a korábbi minták ritkán vagy egyáltalán nem lettek bevizsgálva. A rezisztens és érzékeny esetek arányát a hatóanyagok között páronként khi-négyzet tesztekkel hasonlítottuk össze. Minden elemzést az R statisztikai programmal végeztünk.

Eredmények

Az egyes hatóanyagok elleni rezisztencia előfordulási gyakorisága a ketokonazol, az itrakonazol és az klotrimazol esetében szignifikánsan nőtt az első minta időpontjához képest eltelt napok számának növekedésével. Évenként vizsgálva a rezisztens törzsek arányát az érzékenyekhez képest az előzőekhez hasonló eredményt kaptunk: a ketokonazol, az itrakonazol és az klotrimazol elleni rezisztencia egyre gyakoribbá vált és hasonló (marginálisan nem-szignifikáns) tendenciát mutatott az ekonazol is (1. ábra).

Az idő során szignifikánsan (p=0,001) nőtt az össz-rezisztencia, azaz egy adott mintára azon hatóanyagok száma, amelyekre rezisztencia volt kimutatható, azon hatóanyagok számához arányítva, amelyekre tenyésztve lett (kivéve a terbinafint, a mikonazolt és a grizeofulvint) (2. ábra).

A fülváladékok és bőrkaparékok adatait külön vizsgálva a fülváladékok esetén az előzőekhez hasonlóan szignifikáns össz-rezisztencia növekedés figyelhető meg (p=0,003), a bőrkaparékok esetében viszont nem mutatható ki időbeli változás (p=0,169), itt azonban megjegyzendő, hogy az utolsó vizsgálati évben még csak 1 db bőrkaparék minta került vizsgálatra. A hatóanyagokat páronként összehasonlítva a nisztatinra és az amfotericin B-re szignifikánsan ritkább volt a rezisztencia az elmúlt évben, mint az itrakonazolra, klotrimazolra és ekonazolra (1. táblázat).

Az oki diagnózis felállításában nagy segítséget jelent a klinikus állatorvosnak a mikrobiológiai tenyésztés. A kórokok felderítése és minden tényező együttes kezelése vezethet csak sikerre, különös tekintettel az általában másodlagosan jelentkező gombás megbetegedések tekintetében. Figyelembe kell azonban venni, hogy az antimikotikumok ellen is kialakulhat rezisztencia, ezért a hatóanyag-érzékenységi vizsgálatot ajánlott elvégeztetni különösen idült, visszatérő vagy nem gyógyuló esetekben. Eredményeink alapján látható, hogy az elmúlt években megnőtt egyes szerek ellen a rezisztencia előfordulási gyakorisága, ezért gyógyszerválasztásnál érdemes ezt is figyelembe venni.

Köszönetnyilvánítás

Köszönet illeti Dr. Bókony Veronikát, aki a statisztikai elemzésekben nyújtott segítséget.

Irodalom

1. Carlotti, D. N.: Malassezia dermatitis in the dog. WSAVA. 2001.
2. Charach, M.: Malassezia dermatitis. Can. Vet. J., 1997. 38. 311-314.
3. Dowling, P. M.: Antimicrobial therapy of skin and ear infections. Can. Vet. J., 1996. 37. 695-699.
4. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing: Antifungal agents - Breakpoint tables for interpretation of MICs. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Antifungal_breakpoints_v_6.1.pdf
5. Guillot, J. – Bond, R.: Malassezia pachydermatis: a review. Med. Mycol., 1999. 37. 295-306.
6. Kiss, G. – Szigeti, G.: A Malassezia pachydermatis élesztőgomba előfordulása. Magy. Állatorv. Lapja, 1993. 48. 76-81.
7. Kiss, G. – Szigeti, G.: A Malassezia pachydermatis okozta kórképek diagnosztikája és gyógykezelése. Magy. Állatorv. Lapja, 1994. 49. 745-748.
8. Latha, R. – Sasikala, R. – Muruganandam, N.: Chronic otomycosis due to Malassezia spp. J. Glob. Infect. Dis., 2010. 2. 189-190.
9. Mircean, V. – Titilincu, A. et al.: Malassezia pachydermatis infection in dogs: a retrospective of its epidemiology, clinical and cytological results in Cluj, Romania. Sci. Parasitol., 2010. 11. 153-163.
10. Morris, D. O. – O’Shea, K. et al.: Malassezia pachydermatis carriage in dog owners. Emerg. Ifect. Dis., 2005. 11. 83-88.
11. Robinson, D.: Malassezia: mechanisms of possible drug resistance. Australian College of Veterinary Scientists Dermatology Chapter Science Week Proceedings 2007, Gold Coast: 63-67.
12. Rosco Diagnostica: Susceptibility testing of yeasts 2011. Agar diffusion method with Neo-Sensitabs – using Mueller-Hinton agar with 2% glucose and 0,5 µg/ml methylene blue. http://rosco.dk/gfx/yeasts.pdf

Dr. Bókony Brigitta

Vet-Med-Labor